ELISA試劑盒選擇原則及質(zhì)控標準
目前市場上的 ELISA 試劑盒質(zhì)量參差不齊，試劑盒數(shù)以千計，供應商的科研實力也相差懸殊，試劑盒的質(zhì)量好壞會嚴重影響到檢測結(jié)果的準確性。因此如何去挑選適合自己的試劑盒就顯得特別重要。
以下為歸納ELISA試劑盒選擇需考慮的要素，供科研朋友們參考。
1. 十大選擇原則
1.1 基于研究物種選擇
如果樣品來自經(jīng)典模型，如人、小鼠和大鼠，則可以相對輕松地找到經(jīng)過驗證的ELISA試劑盒。但如果樣品來自猴子等非經(jīng)典模型，則可獲得的商品ELISA試劑盒數(shù)量有限。
如果要檢測這些物種的指標，最好要對待檢物(如有種屬差異性)進行同源性分析以及試劑盒的種屬交叉反應數(shù)據(jù)進行分析。
1.2 基于分析目的選擇
ELISA是一種可用于定性和定量分析的工具。定性ELISA為樣品提供簡單的陽性或陰性結(jié)果，而定量ELISA通過標準曲線反映樣品中分析物的濃度。您想要量化樣品中的分析物還是僅檢測樣品的存在與否？根據(jù)分析目的，您可以選擇定性ELISA或定量ELISA。
1.3 基于檢測樣本選擇
大多數(shù)商業(yè)ELISA試劑盒在血清/血漿和細胞培養(yǎng)上清液中得到驗證。請務必詳細閱讀產(chǎn)品說明書，以確保該產(chǎn)品與樣品兼容。此外，其他因素如溶血和樣品中脂質(zhì)的存在會干擾分析性能。因此，在選擇ELISA試劑盒之前，請考慮這些因素。建議對樣品進行預實驗，以驗證試劑盒是否合適且對樣品是否敏感。
1.4 基于檢測范圍選擇
試劑盒的檢測范圍就是標曲范圍，特別要注意待測樣本濃度是否落在標曲范圍內(nèi)，對于濃度很高的樣本，可以先進行預實驗摸索到比較好的稀釋倍數(shù)后再大量測定樣本。
在此之前，我們可以通過NCBI的文獻，uniprot，pax-dab上給出的蛋白表達量參考值來比較ELISA試劑盒中給出的樣本值與報道值是否一致。
1.5 基于樣本量選擇
商業(yè)化試劑盒的樣品用量通常需要10μL至100μL, 如果您的樣品很珍貴或較難獲取，則需要認真考慮試劑盒對樣品用量的要求。如果樣品量少，最好選擇需要較少量樣品的ELISA試劑盒。
1.6 基于文獻引用選擇
產(chǎn)品的文獻引用特別是高質(zhì)量的 SCI 文章的引用是很多客戶都關心的問題，這是業(yè)界對產(chǎn)品認可的一個非常重要指標，而且對相關用戶的科研有一定的借鑒作用。
CUSABIO試劑盒的客戶引用文獻，目前已達10,000余篇，并以每年數(shù)百篇的數(shù)量在增長。
1.7 基于售前售后服務選擇
在市場經(jīng)濟條件下，服務理念已逐漸被企業(yè)家所重視，企業(yè)的營銷環(huán)境發(fā)生了巨大的變化，高科技的廣泛應用，信息高速流動，產(chǎn)品硬件標準趨同。對客戶所能提供的技術(shù)支持服務、問題處理的及時性、客戶的滿意度等也是選擇產(chǎn)品的考慮因素。
1.8 基于美譽度選擇
一個品牌不光要有知名度，更重要的是美譽度。從同行或?qū)嶒炇彝帕私夤痰目诒餐ㄟ^行業(yè)調(diào)查公司以及網(wǎng)絡，相關宣傳資料等可以找到美譽度高的ELISA試劑盒供應商，在一定程度上可以反映產(chǎn)品的質(zhì)量問題。
1.9 基于成本預算選擇
國際公認的知名品牌一般質(zhì)量可靠，文獻引用多。但國際品牌由于進口和國際運輸?shù)瘸杀据^高，因此售價也較高。其實優(yōu)質(zhì)國產(chǎn)品牌也是不錯的選擇，因省去不少物流和報關費用，與國外進口試劑盒相比價格上有較大的優(yōu)惠，而且能提供比較靈活的包裝規(guī)格, 如48T小包裝，非常適合中國國情。
1.10 基于關鍵技術(shù)參數(shù)選擇
如需選取新的 ELISA 試劑盒，首先需要仔細評估檢測性能。重要參數(shù)包括靈敏度、動態(tài)范圍以及精度，這些在多數(shù)的 ELISA 試劑盒說明書中都有體現(xiàn)。對于典型樣品類型而言，其它參數(shù)對 ELISA 性能更具預測價值。
2. 八大質(zhì)控標準
華美生物CUSABIO ELISA試劑盒是試劑配備完整、質(zhì)控嚴格、經(jīng)過驗證的即用型ELISA試劑盒。在研發(fā)的過程中，采取多個嚴控的步驟以保證試劑盒的卓越品質(zhì)，保證提供給客戶的產(chǎn)品具有線性、特異性、穩(wěn)定性和靈敏度等的高標準。
本小節(jié)旨在為您解讀不同參數(shù)，以幫助您的樣品找到最合適的 ELISA 試劑盒。
2.1 線性范圍
通過線性范圍，我們可以計算出實際的檢測樣本值。
以CSB-E07270h（人脂聯(lián)素(ADP)ELISA Kit）為例的標準曲線。
| ng/ml | OD1 | OD2 | Average | Corrected |
|---|---|---|---|---|
| 100 | 2.839 | 2.897 | 2.868 | 2.718 |
| 50 | 1.968 | 1.974 | 1.971 | 1.821 |
| 25 | 1.144 | 1.192 | 1.168 | 1.018 |
| 12.5 | 0.709 | 0.733 | 0.721 | 0.571 |
| 6.25 | 0.433 | 0.450 | 0.441 | 0.291 |
| 3.125 | 0.303 | 0.301 | 0.302 | 0.152 |
| 1.562 | 0.242 | 0.223 | 0.233 | 0.083 |
| 0 | 0.149 | 0.151 | 0.150 |
2.2 線性
樣本經(jīng)梯度稀釋后檢測分析即為線性分析。
線性是試劑盒準確度和特異性的判定標準。為了評估測定的線性，在各種基質(zhì)中加入高濃度分析物的樣品，并用樣品稀釋劑稀釋以產(chǎn)生具有在測定的動態(tài)范圍內(nèi)的值的樣品。
以CSB-E07270h（人脂聯(lián)素(ADP)ELISA Kit）為例：
血清樣品在1：100,1：200,1：400,1：800下稀釋。
細胞培養(yǎng)物上清液在1：1,1：2,1：4,1：8下稀釋。
測試值在80-120％之間并顯示出良好的線性。
| Sample | Serum(n=4) | |
|---|---|---|
| 1:100 | Average( %) | 91 |
| Range ( %) | 85-97 | |
| 1:200 | Average( %) | 97 |
| Range ( %) | 91-103 | |
| 1:400 | Average( %) | 93 |
| Range ( %) | 85-95 | |
| 1:800 | Average( %) | 95 |
| Range ( %) | 90-100 |
| Sample | Cell Culture Supernates(n=4) | |
|---|---|---|
| 1:1 | Average( %) | 97 |
| Range ( %) | 80-100 | |
| 1:2 | Average( %) | 95 |
| Range ( %) | 91-110 | |
| 1:4 | Average( %) | 90 |
| Range ( %) | 85-95 | |
| 1:8 | Average( %) | 96 |
| Range ( %) | 90-100 |
2.3 最低檢測限
最低檢測限是靈敏度的測試指標。由使用的抗體效價等決定的，在研發(fā)過程中，一般會優(yōu)化保證高靈敏度、低背景的檢測結(jié)果從而大大提高試劑盒的靈敏度。檢測限越低，靈敏度越高。
2.4 精確度
CV (%) 或變異系數(shù)代表了測定的一致性，即同一樣本重復測定的符合程度。
一般是選取同一批次或者不同批次的試劑盒對不同濃度的樣本進行定量檢測，需要盡量降低批次差異帶來的系統(tǒng)誤差，保證相同樣本結(jié)果的重復性。
應考慮兩種類型的精度：批內(nèi)精確度和批間精確度。
批內(nèi)精確度：主要指一次實驗內(nèi)不同孔之間的可重復性。
在一個平板上測試三個已知濃度的樣品20次，以評估CSB-E07270h（人脂聯(lián)素(ADP)ELISA Kit）的精確度：CV％<8％。
批間精確度：主要指不同實驗間結(jié)果的可重復性。
在20個測定中測試三個已知濃度的樣品以評估CSB-E07270h（人脂聯(lián)素(ADP)ELISA Kit）的精確度：CV％<10％。
| Intra-Assay Precision | Inter-Assay Precision | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Sample | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 |
| n | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| Mean(ng/ml) | 13.215 | 12.894 | 13.438 | 12.897 | 13.109 | 12.963 |
| SD | 0.63 | 0.37 | 0.53 | 1.10 | 0.81 | 1.00 |
| CV(%) | 4.75 | 2.847 | 3.931 | 8.562 | 6.145 | 7.741 |
2.5 特異性
特異性是ELISA試劑盒的關鍵指標。主要受到不同物種間的高同源性蛋白、靶蛋白配體或靶蛋白受體的干擾。
CUSABIO選擇具有高特異性的原料，以確保ELISA試劑盒的優(yōu)異特異性，分析交叉反應和干擾，確認只能識別和檢測目標分析物。
2.6 回收率
回收率=靶蛋白的測定濃度/添加的靶蛋白濃度*100%
它反映了樣品分析過程中分析物的損失程度，回收率越高，準確度越高。
回收實驗可檢測試劑盒是否受干擾因子的影響，以不添加蛋白的天然樣本基質(zhì)為空白對照，回收率應介于80%-120%，表明試劑盒的性能較好。
以CSB-E07270h（人脂聯(lián)素，ADP ELISA試劑盒）為例的回收率。
| Sample Type | Average(%) | Range(%) |
|---|---|---|
| Serum (n=5) | 95 | 89-98 |
| EDTA plasma (n=4) | 97 | 90-100 |
2.7 穩(wěn)定性
穩(wěn)定性越好，存儲時間越長。
通常采用加速降解的方法來推斷試劑盒的有效期。通常試劑盒在37℃放置一天折合有效期2個月，實際工作中，一般將試劑盒在37℃破壞3-7天后，然后檢測上述指標，觀察是否在范圍內(nèi)。也可留樣至有效期后進行檢驗，來衡量有效期，對于批量大的指標，可將加速降解和留樣檢驗相結(jié)合的方法。
將CUSABIO ELISA試劑盒的主要原料和測定板在37℃下熱損傷測試7天，然后與在4℃下儲存的原料進行比較。 7天后，OD值≤30％，這是合格的。
2.8 天然樣本驗證
避免使用有外源性污染的樣本，避免血樣本出現(xiàn)溶血、細菌污染，最好使用較新鮮樣本，避免反復凍融。
CUSABIO ELISA試劑盒可以檢測天然樣品，根據(jù)靶點性質(zhì)對天然樣本進行選擇（血清，血漿、細胞上清等），為客戶提供最真實的實驗數(shù)據(jù)參考。
以CSB-E07270h（人脂聯(lián)素(ADP)ELISA Kit）為例，我們在之前以1：500稀釋度測試血清和血漿樣品，測試值為S3-S5。
